概述：骨關節炎（OA）是最常見的關節退行性疾病，其主要病理特征是不可逆的軟骨損傷。隨著再生醫學的發展，間充質干細胞（MSCs）被發現具有強大的治療潛力。本文綜述了間充質干細胞–干細胞外泌體在骨關節炎治療中的作用機制、間充質干細胞-干細胞外泌體的制備研究現狀及其在OA治療中的給藥應用。

簡介

骨關節炎（OA）是最常見的關節炎形式之一。 2021年的數據表明，40歲及以上的成年人中有22%患有膝關節骨關節炎。據估計，全球有超過5億人受到OA的影響，使其成為導致殘疾的第四大原因。它給醫療保健資源帶來巨大負擔，加上失業和提前退休造成的生產力損失，帶來了重大的社會挑戰。骨關節炎是一種復雜的退行性疾病，涉及滑膜關節內的各種成分。其主要病理特征包括關節軟骨喪失、軟骨下骨重塑、滑膜組織炎癥變化以及肌腱和韌帶不穩定。其中，軟骨的不可逆損傷長期以來一直是治療的挑戰。

提取間充質干細胞的外泌體作為骨關節炎治療的藥物系統

由于軟骨組織的無血管性質，其自我修復能力受到嚴重限制。成熟軟骨細胞的增殖能力有限，僅靠周圍軟骨細胞的合成和代謝不足以填補軟骨缺損。目前，臨床上可用于治療軟骨損傷的藥物很少。口服藥物很難在關節腔內達到有效濃度，甚至關節內注射也會很快被淋巴液吸收，導致治療效果短暫并增加感染風險。因此，研究更有效的靶向治療和有效的藥物輸送系統至關重要。

近年來，研究人員不斷開發生長因子、抗炎劑和富血小板血漿（PRP）等新型生物制劑，試圖通過滋養軟骨和抑制關節內炎癥反應來減緩骨關節炎的進展。間充質干細胞（MSC）是一種多能干細胞，以其自我更新和多譜系分化能力而聞名。它們可以通過旁分泌作用影響生物過程，表現出抗炎、鎮痛和免疫調節特性，在軟骨修復研究中已顯示出有希望的結果。

源自間充質干細胞的外泌體 (MSC-Exos) 含有多種蛋白質、mRNA和miRNA，在細胞間通訊中發揮著至關重要的作用。與MSC相比，間充質干細胞外泌體具有安全性更高、易于儲存、副作用最小和道德問題更少等優勢。生物技術的進步進一步發揮了它們在藥物輸送系統中的潛力。本綜述重點關注間充質干細胞外泌體在OA治療中的臨床前景。總結了其生物學特性、制備方法，并探討了它們作為骨關節炎治療藥物遞送系統的潛力。

間充質干細胞和間充質干細胞外泌體在骨關節炎進展中的作用

間充質干細胞主要來源于骨髓，分泌多種細胞因子，包括胰島素樣生長因子1、轉化生長因子-β和血小板衍生生長因子，參與修復過程。損傷后兩周內，間充質干細胞轉化為軟骨細胞樣細胞，合成并分泌富含II型膠原和蛋白聚糖的新ECM。這種組織類似于透明軟骨，可以填充缺損。六到八周后，這種新形成的組織可能從纖維軟骨轉變為透明軟骨。然而，即使缺陷被成功填充，所得軟骨也會表現出硬度降低和抗壓縮性低，使其在機械負載下容易受到進一步損壞。從長遠來看，鄰近的軟骨細胞也可能受到影響，增加骨關節炎擴散到最初局部區域之外的風險。

細胞外囊泡（EV）被認為是細胞間通訊的重要介質。它們在關節內OA進展中的作用受到越來越多的關注。軟骨細胞釋放的外泌體對OA有雙重作用。健康軟骨細胞分泌的EV可以調節M2巨噬細胞的滲透，促進線粒體功能障礙的消除，促進免疫恢復。然而，來自OA軟骨細胞的EVs促進miR-449a-5p/ATG4B介導的自噬，抑制軟骨細胞增殖，增強軟骨細胞凋亡，并上調巨噬細胞促炎介質的產生。

大量研究表明，源自間充質干細胞（MSC）的外泌體可以減緩OA的進展。許多學者已經證明，基于MSC 的OA治療主要通過EV發揮作用，傳遞包括小RNA在內的物質。這些物質調節多種生物活性，例如軟骨細胞凋亡和衰老、滑膜細胞增殖以及促炎介質的釋放。EV根據其特性和來源表現出特定的細胞靶向特性，并且具有生物相容性。因此，人們進行了大量的研究工作來利用MSC-Exos來延遲OA的開發。工程技術的不斷進步旨在開發基于MSC-Exos的藥物輸送系統，為OA治療的新方法鋪平道路。

間充質干細胞外泌體的生物學特性

外泌體的結構

外泌體的直徑約為40-100nm，構成生物納米級球形脂質雙層囊泡的子集，已發現大多數細胞類型都能分泌該囊泡。 “外泌體”一詞最初由Trams等人于1981年創造。指源自質膜的囊泡。這些囊泡被認為具有 5′-核苷酸酶活性，可能具有生理功能，并且源自不同細胞系培養物的擠出。由于外泌體亞型之間和內部固有的異質性以及重疊的特征，將外泌體與其他細胞外囊泡（EV）（例如微泡（MV）和凋亡小體（AB））區分開來可能具有挑戰性。值得注意的是，外泌體被發現封裝了豐富的生物活性物質，包括蛋白質、核酸、脂質、細胞因子、轉錄因子受體等。

外泌體質膜的成分包含多種脂質，包括己糖神經酰胺、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂和飽和脂肪酸。

外泌體蛋白成分可大致分為兩類：常見成分，是囊泡形成和分泌不可或缺的部分；以及特定成分，與起源細胞密切相關。常見成分包括一系列在膜轉運和融合（例如 Rab GTPases）、熱休克反應（例如 HSP70、HSP90）、屬于四跨膜蛋白超家族的蛋白質等過程中發揮關鍵作用的蛋白質（例如CD63，CD81），轉運所需的內體分選復合物（ESCRT）相關蛋白（如Tsg101，Alix），整合素等。 另一種是特異性成分，與它們的祖細胞密切相關，包括細胞特異性CD45和MHC-II等標記物源自抗原呈遞細胞。

間充質干細胞外泌體的生物發生

EV的生物發生始于細胞內體系統內。與MV和AB不同，外泌體不是直接從質膜釋放，而是由多泡體 (MVB) 膜向內出芽產生。MVBs被稱為晚期分類內體（LEs），在早期內體成熟為LEs的過程中發生內體膜內陷，導致管腔內囊泡（ILVs）的形成。該過程導致一些細胞質成分被ILV吞噬并封閉，其中大部分通過MVB與質膜融合釋放到細胞外，部分被轉運至溶酶體降解。這些釋放到細胞外空間的ILV被稱為“外泌體”。 2010年，Sai Kiang Lim團隊首次證明了間充質干細胞通過分泌外泌體的治療作用。

隨后，他們證實MSC-Exos也來源于內體，富含GM1神經節苷脂，表現出高內化活性。進一步的研究一致表明，MSC-Exos與Alix、Tsg101、CD9、CD63 或CD81等其他細胞來源的外泌體具有相似的生物標志物。

間充質干細胞外泌體作為藥物載體的生物學優勢

源自人類細胞的EV具有顯著的生物相容性、低毒性和最小的免疫原性，特別是從自體來源獲得時。尤其是 MSC-Exos在治療各種疾病方面引起了極大關注，包括骨關節炎、腫瘤和自身免疫性疾病（如IBD、SLE和SS），并報告了罕見的嚴重不良反應。它們的雙層脂質囊泡結構和納米級尺寸使它們能夠在長距離運輸過程中保持穩定并穿透組織屏障，包括關節腔。他們已經證明可以有效穿越血腦屏障（BBB）和胎盤屏障等生物屏障。 CD55和CD59等EV標記物可防止補體和凝血因子激活，確保其在體液中廣泛且穩定的分布。

EVs內含有豐富的蛋白質、脂質和各種核酸（如miRNA、mRNA、tRNA、lncRNA和rRNA），與各種藥物表現出優異的生物相容性。除了治療之外，它們還可以攜帶用于疾病診斷的造影。在許多情況下，EV介導的遞送構成了細胞治療的主要機制。干細胞外泌體的一個顯著優勢是它們能夠保留親代細胞的某些特征。同時，不同來源的MSC-Exo的特性和應用也有所不同（表1）。

例如，免疫細胞分泌的EV具有強大的免疫調節能力，研究表明間充質干細胞衍生的EV具有免疫調節和再生功能。 MSC-Exos可以通過多種途徑減少炎癥介質的表達。此外，當與軟骨細胞共培養時，脂肪源性間充質干細胞（AD-MSCs）和軟骨細胞通過EV相互作用，促進AD-MSCs軟骨形成，增加軟骨細胞細胞外基質合成，并抑制細胞衰老。

與細胞療法不同，干細胞外泌體面臨的倫理限制較少，免疫排斥和惡性腫瘤的風險也較低。同時，與需要嚴格條件才能維持活力的MSC相比，MSC-Exos易于維護和儲存。目前，許多研究人員利用人工衍生的細胞外囊泡（例如脂質納米顆粒和脂質體）進行研究，因為它們可以進行精確的工程設計并提供更高的重現性。然而，它們缺乏MSC-EV固有的生物復雜性，往往攜帶單一生物活性分子，無法完全復制MSC-Exos的生物學功能。因此，與納米粒子、脂質體和樹脂聚合物等合成藥物遞送系統相比，天然來源的 EV 具有卓越的治療適用性（圖1）。

間充質干細胞外泌體的制備

間充質干細胞外泌體的來源及制備

間充質干細胞可以來源于多種組織，包括臍帶、脂肪組織、肌肉、牙齒組織、唾液腺、經血等。盡管它們的起源不同，但它們具有共同的特征，例如自我更新、多譜系分化潛力和免疫調節特性。國際細胞治療學會定義了鑒定人類間充質干細胞的三個基本標準：

• 當維持在標準培養條件下時，間充質干細胞必須粘附在塑料表面。
• MSC必須表達CD105、CD73和CD90，而不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-DR表面標志物。
• MSC必須能夠在體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。間充質干細胞可以從各種關節組織中分離出來，包括滑膜組織、半月板、韌帶、脂肪墊和軟骨。間充質干細胞可以從各種關節組織中分離出來，包括滑膜組織、半月板、韌帶、脂肪墊和軟骨。

大多數MSC來源缺乏標準化的制備程序，包括組織切碎、可選的酶消化和外植體培養。例如，成熟AD-MSC的培養通常涉及以下步驟：

首先，用PBS清洗獲得的脂肪組織，以去除多余的血液成分、局部麻醉劑或關節積液。

接下來，將組織切碎，并利用膠原酶消除纖維狀膠原。離心和過濾后，將分離的脂肪碎片引入培養基中進行細胞生長。這些細胞通常傳代至第3代至第5代用于后續實驗。

不同實驗室的基礎培養基、膠原酶的類型和濃度、消化時間、離心速度、持續時間和其他細節存在差異。

MSC的鑒定涉及對其表面標記物進行流式細胞術分析。不同來源的MSC的表面標志物特征不同。 AD-MSC和BMSC均在其細胞表面表達CD13、CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、MHC I 類和 HLA-ABC。值得注意的是，AD-MSC不表達CD38、CD45、CD106、HLA-DR、DP、DQ（MHC II 類）、CD80、CD86、CD40 或 CD154。

間充質干細胞外泌體的分離鑒定

作為體內的藥物載體，從間充質干細胞中高效獲取純凈、安全、充足的外泌體至關重要。在實現高效大規模生產的同時，確保外泌體的純度和均質性提出了技術挑戰。已采用多種方法從MSC中分離外泌體，其中差速離心是最傳統的方法。

目前普遍使用第3代至第6代MSC。當細胞匯合達到80%~90%時，更換無血清培養基，培養細胞24~48 h。所得的細胞培養上清液不僅含有外泌體，還含有多種成分，如死細胞、細胞碎片、微泡和凋亡小體。采用超速離心根據大小和密度分離外泌體，然后使用透射電子顯微鏡 (TEM) 進行鑒定。差速離心可產生高純度但效率較低。相比之下，超濾由于設備要求較低、處理時間較短，更適合大規模生產。尺寸排阻色譜法 (SEC) 和離子交換色譜法 (IEC) 也能產生高純度的外泌體。免疫分離基于針對 CD9、CD63、CD81、Alix 和熱休克蛋白等表面蛋白的抗體的特異性結合，可提供高純度，但不太適合大規模生產。然而，其高特異性可用于分離特定的外泌體亞群，具有獨特的臨床價值。

外泌體鑒定技術已經成熟，MSCs來源的外泌體與其他來源的外泌體在形態、分離和儲存條件上沒有顯著差異。外泌體鑒定的基本步驟包括形態觀察和表面標志物鑒定。透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）是外泌體觀察的常用技術。冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM) 可提供更準確的生物信息、更高的分辨率，并允許在自然水合狀態下對外泌體進行成像，無需化學固定或染色，從而保留其自然結構。冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）是冷凍電鏡的延伸，通過外泌體的三維成像提供詳細的結構信息。

間充質干細胞外泌體治療骨關節炎的研究現狀

間充質干細胞治療骨關節炎的潛力

MSCs已被證明具有在體內和體外分化成軟骨細胞的潛力。如前所述，OA軟骨損傷后，內源性（來自細胞周基質或循環）或外源性MSC被募集到損傷部位，在那里它們部分地進行軟骨分化，促進軟骨再生。 MSC-Exos影響MSC歸巢并促進軟骨分化。

• 嚴康等人利用MSC-Exo傳遞circRNA-0001236，發現它通過miR-3677-3p/Sox9軸增強MSC軟骨形成，從而抑制軟骨降解。然而，內源性MSC的數量有限，外源性MSC的歸巢能力也受到限制。僅僅依靠間充質干細胞軟骨形成會產生次優的結果。雖然MSC-Exos不能直接增加MSC的數量，但它們可以通過替代途徑增強軟骨修復。
• 陶舒等人采用miRNA-210過表達BMSCs-Exos，通過NF-kβ途徑顯著減少LPS誘導的軟骨損傷。 AD-MSCs-Exos將miR-100-5p遞送至軟骨細胞，通過抑制mTOR途徑顯著增強細胞自噬，從而減少軟骨損傷。動物實驗證明了步態的顯著改善。

關節腔內的炎癥會加速OA的進展，通常先于放射學表現，并與臨床疼痛顯著相關。因此，控制早期OA炎癥對于減緩其進展和改善癥狀至關重要。間充質干細胞調節關節內的各種免疫細胞。研究人員將AD-MSCs置于炎癥刺激TNF-α和IFN-γ下，發現血管內皮生長因子和成纖維細胞生長因子基因表達增加，而促炎因子TNFA和PTGS2基因表達減少，表明AD-MSCs可以減輕炎癥通過炎癥環境中的旁分泌作用。鑒于MSC-Exosomes優異的遞送能力和豐富的生物學功能，其作為治療OA的藥物遞送系統的潛力是巨大的，相關模型的研究也日益成熟（圖2）。

基于間充質干細胞外泌體的給藥系統在骨關節炎治療中的應用

使用MSC-Exos的無細胞療法的研究落后于MSC療法。目前，基于MSC-Exos的靶向給藥系統（DDS）的開發還處于早期階段，主要局限于體外或動物實驗。我們總結了過去5年的代表性研究（表2）。最常用的 MSC-Exo遞送涉及各種microRNA。多種microRNA已被證明可傳遞至關節內的軟骨細胞或免疫細胞，通過促進軟骨形成、抑制細胞凋亡和免疫調節來改善OA預后。

Liang等利用CAP標記的外泌體，其特點是延長關節保留時間、有限的體內擴散以及將 miR-140遞送至深層軟骨區域的能力。這種遞送有效地抑制了軟骨降解酶，從而減輕了大鼠模型中骨關節炎的進展（圖3）。

• (A)外泌體表面工程示意圖，用于將miR-140靶向遞送至軟骨細胞以進行 OA 治療。
• (B)用CAP-外泌體/miR-140或外泌體/miR-140制劑治療的DMM大鼠軟骨的組織學評估：軟骨組織的染色圖像。

截至2023年9月，美國國立衛生研究院 (NIH) 數據庫中列出了238項間充質干細胞治療骨關節炎的注冊臨床試驗。 MSC治療的安全性和有效性已得到很大程度上驗證。

然而，只有一項與MSC-Exos相關的注冊臨床試驗（NCT05060107），由Espinoza F于2021年10月發起。該研究旨在評估通過膝關節內注射輸送的同種異體間充質基質細胞外泌體的安全性。患有輕度至中度骨關節炎癥狀的患者。他們計劃招募10名患者參加這項1期試驗，隨訪期長達12個月。不過，實驗結果尚未公布。

結論與展望

由于對軟骨造成不可修復的損傷，目前骨關節炎的非手術治療方法并不是很有效，這是一個巨大的挑戰。隨著再生醫學的進步，細胞療法，特別是涉及間充質干細胞的細胞療法，得到了廣泛的研究。這些研究在各種臨床前試驗中顯示出有希望的結果。使用MSC-Exos治療骨關節炎不僅克服了與細胞療法相關的倫理限制，而且還發揮了其作為藥物載體的潛力。

未來的研究還將解決關節腔內持續藥物釋放的需求。該方法旨在顯著減少關節內注射的頻率，從而降低經濟成本并最大限度地減少副作用。

參考資料：Wen S, Huang X, Ma J, Zhao G, Ma T, Chen K, Huang G, Chen J, Shi J and Wang S (2024) Exosomes derived from MSC as drug system in osteoarthritis therapy. Front. Bioeng. Biotechnol. 12:1331218. doi: 10.3389/fbioe.2024.1331218

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