肝硬化是一種可導致肝功能衰竭的慢性疾病。目前，降低死亡率的可行選擇是肝移植。然而，移植手術是高度侵入性的。因此，已經開發(fā)出基于細胞的療法作為替代方案。基于臨床前研究的有希望的發(fā)現，一些新的試驗已經注冊。

目前肝纖維化的治療方法分為五類：

• 1) 控制原發(fā)性肝病，
• 2) 靶向HSC受體-配體相互作用和細胞內信號，
• 3) 抑制纖維發(fā)生或基質降解。
• 4) 減少活化HSC的數量，
• 5) 基于細胞的治療。

目前細胞的療法主要關注改善肝纖維化，但它也能夠產生其他有益效果（包括減少炎癥和促進肝臟再生）。

其中之一是自體骨髓細胞輸注療法，自體骨髓細胞輸注 (ABMi) 療法的第一項臨床研究于2003年開始，其中患者自身的骨髓細胞被采集并重新注射。在這種療法中，ABMi可改善肝硬化患者的肝纖維化并改善肝功能（如血清白蛋白水平升高、腹水減少和Child-Pugh評分降低所示），而不會引起任何重大不良事件。ABM i還促進人體肝臟中肝臟固有再生的順序激活。

現在，大多數試驗都集中在適合同種異體給藥的低免疫原性間充質干細胞 (MSC) 上。然而，盡管進行了大約20年的研究，只有有限數量的基于細胞的療法進入了常規(guī)實踐。此外，基于細胞的療法的潛在缺點包括對可能施用的細胞數量的限制，以及它們無法滲透目標器官。

另一方面，這些研究表明，間充質干細胞作為“傳導細胞”，通過細胞外囊泡（EV）或外泌體信號調節(jié)包括巨噬細胞在內的宿主細胞，從而改善肝纖維化并促進再生。因此，利用細胞衍生的EV或外泌體的無細胞療法的概念正在引起人們的關注。無細胞療法可以安全地大劑量給藥，并且能夠滲透靶器官。

然而，無細胞療法的發(fā)展也面臨著一系列挑戰(zhàn)，而且這種療法在肝病的背景下可能無法完全治愈。這篇綜述描述了細胞療法研究的歷史和無細胞療法的最新進展，并討論了對更有效療法的需求。

間充質干細胞治療肝硬化的現狀及未來無細胞治療的展望

干細胞治療：間充質干細胞和巨噬細胞治療肝硬化的特性

間充質干細胞的主要治療（抗炎、抗纖維化、抗氧化和血管生成）作用是由于它們的可溶性產物，包括趨化因子、細胞因子、營養(yǎng)因子、EV和外泌體。間充質干細胞治療肝硬化的主要機制是減少炎癥。

另一個重要的MSC特征通常是低免疫原性。臨床研究表明，它們在影響廣泛器官（包括肝臟、神經、肺、心臟和腸道）的疾病中具有治療潛力。

巨噬細胞表現出多樣的表型和高可塑性，包括兩種主要的代表性表型：“經典激活”(M1) 和“交替激活”(M2)。在肝損傷期間，促炎性M1巨噬細胞通過激活HSC和肌成纖維細胞促進纖維化。相比之下，在肝損傷過程穩(wěn)定后，M2型巨噬細胞有助于炎癥消退和纖維化逆轉，后者部分通過基質金屬蛋白酶。此外，如前所述，巨噬細胞能夠通過產生HGF、OSM和Wnt3A來影響肝干/祖細胞的分化和表型命運決定。

MSC也會產生相同的因子（TSG-6、PGE2和IL-13），并以類似的方式促進宿主巨噬細胞的極化。此外，我們之前曾報道過，MSC促進宿主嗜中性粒細胞和單核細胞的肝臟浸潤，從而通過產生MMP促進纖維化改善。這些發(fā)現表明，遠程MSCs充當“傳導細胞”（圖2)，通過包括EV或外泌體在內的可溶性因子調節(jié)巨噬細胞、中性粒細胞和單核細胞的功能，從而改善肝纖維化并促進肝再生。

干細胞治療：間充質干細胞和巨噬細胞治療肝病的臨床試驗

盡管MSCs和巨噬細胞都代表了用于細胞治療的有前途的候選者，但目前的大多數臨床試驗都集中在MSCs 上。根據ClinicalTrials.gov的數據，超過1,100個間充質干細胞治療的臨床試驗已經在各個學科注冊，其中 51個在2006年之后開始研究基于細胞的肝病治療。此后，基于細胞的治療臨床試驗注冊數量（包括骨髓、脂肪組織、臍帶組織和牙髓在內的細胞來源，以及包括外周靜脈和動脈注射在內的給藥途徑，隨著該方法獲得認可，逐漸增加到頂峰。

2017年，日本注冊了一項I期和II期臨床試驗（日本首次涉及MSC的臨床試驗），重點是在肝硬化患者中輸注脂肪來源的MSC（NCT：03254758）。涉及同種異體間充質干細胞（不使用免疫抑制劑）的臨床試驗在完成I期后進入II期。但是，自2017年以來，臨床試驗的數量一直在下降（圖3)。這種趨勢可能是由于新穎性下降，將臨床前研究轉化為臨床干預的進展緩慢，以及將重點轉向包含EV或外泌體的無細胞療法的趨勢。

此外，為了描述以MSC為導向的臨床試驗的最新趨勢，我們根據ClinicalTrials.gov（表格1). 其中大部分在亞洲國家注冊。研究在細胞來源、自體與同種異體性質以及肝硬化的病因學方面各不相同。然而，在大多數研究（12項中的11項）中，MSC給藥是通過外周注射每劑約1×10⁶MSC/kg。研究不僅關注肝硬化，還關注急性慢性肝衰竭 (ACLF)。由于MSCs在炎癥期間表現出更強的治療效果，因此它們在ACLF的情況下可能特別有效。總而言之，許多面向MSC的臨床試驗尚未超過I期或II期。

關于以巨噬細胞為導向的細胞療法，愛丁堡大學也報道了進一步闡明巨噬細胞特征的臨床試驗。靜脈內自體巨噬細胞治療的首次人體1期劑量遞增試驗納入了9名患有肝硬化和終末期肝病 (MELD) 評分為10–16的成人模型。在該試驗中，巨噬細胞是從患者單核細胞白細胞分離術衍生的單核細胞中產生的，該單核細胞在CSF-1存在的情況下進行培養(yǎng)。盡管巨噬細胞可能具有免疫原性，但未報告輸血反應、劑量限制性毒性或巨噬細胞活化綜合征，并且所有參與者在1年時仍然存活且未進行移植。

此外，1年后，9名患者中有7名MELD評分下降，9名患者中有5名肝纖維化標志物下降。由于巨噬細胞也是肝臟再生的重要組成部分，因此預計會加速這一領域的研究。

干細胞治療：優(yōu)點和局限性

如前所述，基于細胞的療法具有許多優(yōu)點。尤其是對于MSC，細胞相對容易獲得、培養(yǎng)、擴增、表征質量控制、計數和評估活力。此外，由于MSC在炎癥過程中治療效果增強，預處理可以增強其治療效果。最后，細胞修飾的許多途徑都是可能的。盡管施用的細胞被困在肺血管系統(tǒng)中，但現有臨床試驗報告的主要不良事件很少，包括肺栓塞。盡管由于基于免疫原性的限制，施用的巨噬細胞是自體的，但它們現在可以通過侵入性較小的方法獲得。此外，在肝臟內局部引發(fā)和影響宿主巨噬細胞發(fā)育的能力（即不需要外源性給藥）將是一個更具吸引力的可能性。

然而，基于細胞的療法也有一定的局限性。例如，對肺栓塞風險的擔憂繼續(xù)限制劑量，并且施用的細胞不會進入靶器官。盡管細胞確實繼續(xù)發(fā)揮遠程治療作用，但直接作用于受損部位的治療劑將是更可取的。此外，鑒于干細胞的分化傾向，在長期培養(yǎng)過程中很難保持穩(wěn)定的表型。因此，商業(yè)化需要嚴格的質量控制。這種擔憂推動了對替代治療策略的探索，而無細胞療法可能會克服與細胞療法相關的一些局限性。

未來的無細胞療法：EVS和外泌體的特征

細胞自然釋放的膜結合顆粒的通用術語是EV；外泌體是這些的亞型。EV和外泌體曾經被認為是細胞碎片的“垃圾袋”，現在正在探索它們作為下一代診斷和治療工具的潛力。異類EV包含各種不同大小、不同含量的顆粒。具體而言，外泌體的直徑為40-100nm——對應于蔗糖溶液中1.13-1.19 g/mL的密度——并且可以通過100,000×g的超速離心沉淀。它們包含蛋白質、信使RNA、轉移RNA、微小 RNA、基因組 DNA 和互補 DNA的混合物。

關于肝病，我們之前曾報道過MSC表現出遠程治療效果，這是一種可歸因于EV或外泌體的現象。此外，據報道，外泌體可改善肝硬化小鼠的肝纖維化，在小鼠肝損傷模型中促進肝再生和肝細胞增殖（通過上調 Bclxl 蛋白），通過抑制巨噬細胞緩解急性肝衰竭NLRP3炎性體活性（另外表明它們在急性肝損傷期間的潛在效用），并改善D-半乳糖胺和腫瘤壞死因子-α誘導的小鼠肝衰竭后的存活率。

未來的無細胞療法：涉及EVS和外泌體的臨床試驗

為了描述相關的近期臨床研究趨勢，我們確定了在ClinicalTrials.gov上注冊的面向EV或外泌體的臨床試驗。結果包括側重于外泌體治療應用和癌癥診斷外泌體分析的試驗。不包括觀察性研究，注冊了26項面向外泌體的治療性臨床試驗。其中，10個專注于癌癥診斷；三個分別側重于肺部疾病、神經系統(tǒng)疾病和皮膚病；兩個分別關注心臟病、眼科疾病和多器官衰竭，一個關注代謝疾病（圖4)。據我們所知，目前還沒有注冊以EV或外泌體為導向的針對肝病的臨床試驗。

未來的無細胞療法：優(yōu)點和局限性

鑒于EV和外泌體的直徑較小，靜脈內給藥后血栓形成的相關風險被認為相對于干細胞（例如，MSC）所造成的風險要低得多。如果確認無細胞治療效果是劑量依賴性的，那么使用大量EV或外泌體的能力將是一個顯著優(yōu)勢。此外，EV或外泌體直接浸潤受損靶器官的能力可能會比遠距離干細胞產生更大的療效。一些研究甚至檢驗了EV或外泌體在靶向藥物遞送中的應用。

然而，盡管無細胞療法克服了與細胞療法相關的許多局限性，但前者也有其局限性。如前所述，目前還沒有用于生產大量EV或外泌體的標準化方法。此外，尚不清楚使用分離的EV或外泌體是否排除了基于細胞的治療相關治療效果的重要因素。最后，由于無細胞療法的快速發(fā)展，圍繞無細胞療法的相關醫(yī)學法律規(guī)范尚未充分建立。顯然，無細胞療法領域仍處于起步階段，需要進行大量的進一步研究。

結論和未來展望

基于干細胞治療肝硬化已被開發(fā)為肝移植的替代治療肝病的方法，但尚未取得超越早期臨床試驗的進展。盡管如此，無細胞療法——克服了與細胞療法相關的一些局限性——作為下一代治療技術已經在開發(fā)中，與肝病相關的臨床試驗有望在不久的將來開始為肝病患者帶來新的希望。

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