背景：大腦作為人類功能活動的“總部”，損傷后的再生和修復是當今科學界面臨的難題。腦神經元具有難以再生的遺傳特性以及創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后的抑制性微環(huán)境是神經修復的關鍵困難。

因此，TBI后功能恢復的重點是促進損傷后的神經再生，創(chuàng)造合適的微環(huán)境。越來越多的證據證明，使用干細胞來源的外泌體比直接移植干細胞可以在治療TBI方面帶來更多益處，為神經再生創(chuàng)造新的治療途徑。

神經干細胞外泌體成為治療創(chuàng)傷性腦損傷的新策略

自1987年Johnstone首次在綿羊網織紅細胞中發(fā)現(xiàn)外泌體并將其命名為“外泌體”以來，目前用于腦再生的無細胞治療策略已經得到發(fā)展。該領域取得了顯著的進展，特別是在TBI再生修復中的應用。我們對外泌體生物學效應理解的進展對再生醫(yī)學領域產生了重大影響，它們可以廣泛用作腦修復細胞信號傳導的有效介質。研究證實，外泌體對于大腦內外的細胞間通訊至關重要，表明外泌體不僅在細胞內短距離傳輸信號，而且還通過腦脊液廣泛傳播到整個大腦。

近日，國際《Stem Cell Research&Therapy》期刊發(fā)表了一項《神經干細胞來源的外泌體成為創(chuàng)傷性腦損傷的無細胞治療策略》的綜述，該綜述首先描述了神經干細胞外泌體的基本特征和生物學效應。其次，總結了神經干細胞分泌的外泌體在TBI診斷和治療中的作用及其可能機制。最后，討論了神經干細胞外泌體治療創(chuàng)傷性腦損傷所面臨的挑戰(zhàn)。

神經干細胞與外泌體概述

外泌體是細胞分泌的小囊泡，攜帶生物信息，并通過內體和質膜途徑產生。外泌體不僅可以作為疾病診斷和治療的生物標志物，而且可以作為細胞間通訊的主要媒介。此外，外泌體在膜細胞向細胞質蛋白、脂質和核糖核酸（RNA）的運輸中發(fā)揮著關鍵作用。外泌體的生物發(fā)生包括其內容物以及隨后的途徑和機制。

神經干細胞可以分化為神經元和神經膠質細胞，以替代因損傷而受損或耗盡的神經細胞。因此，神經干細胞可以作為一種天然的活躍活性資源，并被認為是治療TBI的潛在工具。大量研究發(fā)現(xiàn)神經干細胞移植可以顯著再生受損組織。NSC分泌的外泌體被認為可以增加基于干細胞的治療的優(yōu)勢，因為它們能夠克服其母體神經干細胞移植治療的風險和困難。

有人提出神經干細胞外泌體可以自由穿透血腦屏障（BBB）、抑制細胞凋亡、介導免疫調節(jié)、抑制炎癥和調節(jié)自噬。神經干細胞外泌體作為無干細胞治療策略，可以滿足修復和再生治療的需求，成為TBI治療的非常有前景的候選者。

外泌體含量及鑒定

外泌體富含脂質、蛋白質、核酸等生物活性物質，在調節(jié)細胞生理功能、影響細胞間信息傳遞中發(fā)揮著至關重要的作用。人們普遍認為，外泌體成分可能因其來源和細胞類型而異。外泌體已被鑒定含有4563個蛋白質、764個miRNA、1639個mRNA和194個脂質。

值得注意的是，人類神經干細胞（hNSCs）除了表達外泌體的常見標記蛋白CD63和CD81外，還表達神經干細胞的標記蛋白c-MYC蛋白。第二代測序顯示，hNSC外泌體所含的miRNA與其他來源的miRNA不同。hNSCs分泌的miRNA有113種，其中高表達的miRNA有5種，包括hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4508、hsa-miR-4492和hsa-miR-4516。作為高表達的miRNA之一，miR-1246是一種p53靶向miRNA，在調控細胞發(fā)育和凋亡方面發(fā)揮著重要作用。另一項研究表明，miR-21a在NSCs分泌的外泌體中高表達，可促進神經細胞的分化和再生（圖1）。

神經干細胞外泌體可能通過作用于周圍細胞來發(fā)揮作用。例如，神經干細胞衍生的外泌體，尤其是miR-9，通過抑制Hes1促進NSC分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞。此外，外泌體分泌的miR-150-3p通過靶向CASP2來防止神經元凋亡，或者高水平的miR-21a可以促進NSCs分化為神經元，從而導致膠質疤痕減少

外泌體的發(fā)生途徑和機制

外泌體作為細胞內的主要通訊媒介，可以通過不同途徑與靶細胞結合以傳遞信息。目前普遍認為外泌體的生物合成主要涉及質膜途徑和內體途徑。在內體途徑中，早期內體從質膜出芽形成早期內體；隨后，早期內體萌發(fā)腔內囊泡（ILV）形成多囊泡體（MVB），最后，MVB與質膜融合釋放外泌體。此外，一些證據已經證實外泌體可以直接從質膜出芽，即質膜途徑。

目前，研究最多的外泌體生物發(fā)生途徑是內體途徑。細胞質膜內陷可形成早期內體，早期內體（Rab5為標志物）通過酸化和物質交換成熟為晚期內體（Rab7為標志物）。晚期內體最終可以形成含有ILV的MVB，ILV由多泡膜向內萌芽的凹陷構成。多囊泡通過與溶酶體或自噬溶酶體融合而被降解，與細胞質膜融合導致管腔囊泡分泌到細胞外，最終形成直徑范圍為40至160nm的外泌體（圖2）。

外泌體的純化和儲存

由于外泌體體積小、密度低且成分相似，外泌體的分離對其分離提出了巨大的挑戰(zhàn)。NSCs和其他細胞分泌的外泌體的常見分離方法主要包括超速離心、超濾和尺寸排阻層析、聚合物沉淀、免疫親和捕獲層析和微流控芯片分離。在這些方法中，超速離心是最常用的方法，目前被視為外泌體提取的金標準。此外，不同的分離技術也會影響外泌體的生物活性。因此，標準化的分離流程和定量方法對于外泌體質量和臨床應用至關重要。

對于外泌體的保存條件來說，能夠在體外保持外泌體的完整性也是極其重要的。一些研究表明，不同的儲存條件可能會影響外泌體的大小，但對外泌體攜帶的貨物沒有太大影響。數(shù)據顯示，在37°C下儲存兩天后，外泌體大小減少了約60%。4℃保存兩天后外泌體大小基本保持不變，而3~4天后外泌體大小明顯下降。有趣的是，外泌體的形態(tài)和大小在?20°C下保存可以保持一個月。迄今為止，仍缺乏證據表明外泌體可以在體外穩(wěn)定保存很長時間，因此在體外維持外泌體完整性的挑戰(zhàn)仍然嚴峻。

神經干細胞外泌體的生物學效應

神經干細胞分泌的外泌體參與了中樞神經系統(tǒng)中神經元與小膠質細胞之間的多種相互作用。此外，神經干細胞分泌的外泌體可將活性物質從神經元轉移到星形膠質細胞，從而調節(jié)星形膠質細胞的功能、突觸活動、神經血管完整性和髓鞘化。一方面，NSCs分泌的外泌體可將特定顆粒從原始細胞攜帶到靶細胞，導致病理變化加劇，如阿爾茨海默病（AD）中的淀粉樣β蛋白（Aβ）和tau蛋白β、海綿狀腦病中的朊病毒蛋白和帕金森病（PD）中的α-突觸核蛋白。另一方面，神經干細胞外泌體可作為神經保護因子，促進周圍神經再生和神經損傷修復。

神經干細胞外泌體治療創(chuàng)傷性腦損傷的機制

先前的一項研究表明，神經干細胞有望成為實驗模型和臨床實踐中TBI治療的有效策略。然而，最近已經證明，神經干細胞與創(chuàng)傷性腦損傷后腦重塑和功能恢復相關的主要機制并不依賴于細胞替代效用，而是可能依賴于旁分泌效應，例如神經干細胞分泌的外泌體。

近期研究證實，神經干細胞外泌體作為信號分子的載體，參與介導腦損傷后病理過程中神經細胞的通訊，通過調節(jié)神經細胞間的信息通訊參與TBI后損傷的發(fā)生和修復。細胞。小RNA測序、蛋白質組學分析以及精選miRNA和蛋白質的驗證證明，人iPSC衍生的NSC的外泌體富含參與促神經再生、抗凋亡、抗炎癥、抗氧化作用、血腦屏障修復的miRNA和蛋白質此外，它們還含有促進突觸可塑性和增強認知功能恢復的miRNA和/或蛋白質（圖3）。

• NSCs分泌的外泌體含有多種細胞活性成分，可以自由穿過血腦屏障、抑制炎癥反應和神經細胞凋亡、促進神經再生和血管生成等。
• 針對神經再生，NSCs分泌含有circAcbd6的外泌體，進一步促進NSCs的分化通過miR-320-5p/氧甾醇結合蛋白相關蛋白2軸進入膽堿能神經元。
• NSC衍生的外泌體含有抑制炎癥反應、下調TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子表達并促進小膠質細胞從M1向M2表型極化的成分。
• 抗凋亡后，NSC分泌的外泌體轉移miR-150-3p（一種富集的miRNA），并抑制神經元凋亡。NSC外泌體引起的自噬標記蛋白LC3B和beclin-1表達增加也減少了神經細胞的凋亡。為了促進血管生成，神經干細胞外泌體可以上調VEGF水平，從而加速血管生成。

工程神經干細胞外泌體針對腦損傷的潛在治療作用

由于其獨特的納米結構、缺乏免疫原性、低毒性、良好的滲透性，具有穿越血腦屏障的能力，加之它們在組織再生、免疫等方面的重要作用，調控和疾病識別，外泌體在中樞神經系統(tǒng)損傷的治療中具有巨大的治療潛力，但天然外泌體的靶向能力較差，從而大大降低了治療效果。

工程化外泌體具有主動靶向特定細胞類型和組織的能力。納米技術的發(fā)展為靶向藥物遞送帶來了新的希望，基于外泌體結構和功能的納米制劑有望克服中樞神經系統(tǒng)障礙，將神經保護分子轉移至腦實質，為針對腦區(qū)域的治療提供有效的治療手段中樞神經系統(tǒng)損傷疾病。

制備工程外泌體的策略之一是細胞工程。親代細胞的基因工程是常用的細胞工程技術之一，即在外泌體生物發(fā)生過程中直接修飾外泌體。

外泌體工程學是即在適當條件下利用特定技術對純化的外泌體表面蛋白或內容物進行修飾，主要分為孵育法、物理法、皂化法和表面修飾法。與細胞工程的低效率和高難度相比，直接修飾純化的天然外泌體可以直接獲得大量工程外泌體，減少細胞培養(yǎng)過程中的不確定性，對工程外泌體的大規(guī)模生產具有重要意義（圖4）。

前景和挑戰(zhàn)

與大多數(shù)外泌體類似，神經干細胞分泌的外泌體在腦損傷的治療中具有以下優(yōu)勢。

• 首先，外泌體是納米大小的囊泡，可以順利穿過血腦屏障并且易于吸收，靜脈注射后小血管閉塞的可能性非常低。
• 其次，外泌體負責細胞間的傳遞，當腦損傷發(fā)生時，內源性NSCs釋放外泌體，向其他細胞傳達需要救援的信息，實現(xiàn)受損大腦的修復和再生。
• 第三，NSCs分泌的外泌體具有低免疫原性，為神經系統(tǒng)疾病提供了一種無細胞療法，且沒有明顯的副作用。
• 第四，與干細胞培養(yǎng)和保存的難度相比，植入后生長的風險無法控制，并且由于懷疑形成腫瘤，干細胞外泌體可以在制劑中儲存并注射到血液中，很容易被利用吸收。

鑒于此，研究神經干細胞外泌體為優(yōu)化基于細胞的療法提供了見解，并有助于理解腦損傷后基于外泌體療法的再生和修復的確切機制。

神經干細胞分泌的外泌體在再生治療領域顯示出前景，包括TBI的治療。盡管TBI治療中神經干細胞衍生的外泌體研究的數(shù)量不斷增加且取得了有希望的結果，但臨床前和臨床研究的轉化研究仍有很長的路要走。

目前，尚缺乏安全、有效、高產的外泌體生產和純化方法，限制了外泌體用于疾病治療的臨床轉化。因此，應深入探討神經干細胞外泌體的純化和保存方法標準，以確保獲得高產量、高質量的外泌體，促進神經干細胞外泌體用于TBI治療的臨床轉化。

盡管目前NSC外泌體的臨床轉化面臨挑戰(zhàn)，但除了基因修飾外，神經干細胞外泌體還可以與載藥納米粒子結合，發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，賦予神經干細胞外泌體未來更廣闊的發(fā)展前景。

結論

總之，目前最有希望的腦損傷治療方法之一是基于神經干細胞外泌體給藥。由于大腦神經損傷后神經干細胞外泌體具有有益作用，因此有必要探索神經干細胞外泌體調節(jié)神經再生的潛在機制。

神經干細胞來源的外泌體治療腦損傷的潛在機制可能是由于其神經再生、抗炎、血管生成和抗凋亡特性（圖3）。此外，考慮到神經干細胞的工程化外泌體可能會在不同水平上影響腦功能，不同治療途徑（靜脈內、鼻內或原位）的TBI療效也有所不同。因此，根據TBI患者的需求定制神經干細胞外泌體治療策略對于增強基于外泌體的無細胞療法的效果至關重要。

參考資料：Zhong, L., Wang, J., Wang, P. et al. Neural stem cell-derived exosomes and regeneration: cell-free therapeutic strategies for traumatic brain injury. Stem Cell Res Ther 14, 198 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03409-1

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